Livingstone a Glasgow közeli Blantyre-ben született, egy munkáscsalád hét gyermeke közül másodikként. A család szegény volt (a gyermekek egy szobában nőttek fel), de hitbuzgalom, tudásvágy és küldetéstudat jellemezte őket. David már tízéves korától egész nap a pamutfonóban dolgozott, de első keresetéből latin nyelvkönyvet vett, és esti iskolába járt. Mélyen hívő kálvinista keresztényként hamar elhatározta, hogy orvos-misszionárius lesz: 1836-tól a glasgow-i egyetemen munka mellett görögöt, teológiát és orvostant hallgatott, 1840-ben Londonban szerzett orvosi oklevelet.
1840-ben hittérítő lett, hajója a következő év tavaszán érkezett Fokvárosba. Innen az angol kolóniától északra fekvő, feltáratlan vidékre indult, megismerte a helyi nyelveket és szokásokat, és messzebb hatolt be a Kalahári-medencébe, mint előtte bármely fehér ember. Livingstone nem volt hagyományos hittérítő. Miután megtapasztalta, milyen károkat okozott a rabszolga-kereskedelem az ott élőknek, meggyőződése lett, hogy az ő feladata megtalálni az utat a kontinens szívébe, amelyet azután a misszionáriusok és kereskedők használhatnak, akik így megingathatják a rabszolga-kereskedelmet. Az afrikaiakat magával egyenlőknek tekintette, iparra és földművelésre próbálta őket tanítani. Harminc évet töltött Afrikában és a becslések szerint halála pillanatában 46 ezer kilométer állt mögötte, amelyet főként gyalog tett meg.
Neve az 1849-es, Williamm Oswell vezette expedíció révén vált ismertté. Az út során eljutottak a Zambézi és a Cuando folyókig, felfedezték a Ngami-tavat a mai Botswanában, ezért a Brit Királyi Földrajzi Társaságtól aranyérmet és pénzjutalmat kapott, a társaság később is támogatta őt.
1853-ban újfent a kontinens belsejébe indult, hogy "terjessze a kereszténységet, a kereskedelmet és a civilizációt", megtalálja az utat az Atlanti-óceánhoz. A Zambézi menti Linyantiból indulva sok viszontagság és betegség után 1854 májusában elérte az angolai Luandát, majd épségben visszajutott kiinduló állomására. Néhány hónap pihenő után, 1855 novemberében a Zambézit kelet felé követve a mai Zambia és Zimbabwe határán felfedezte a száz méter magas vízesést, amelyet Viktória királynőről nevezett el. 1856 májusában a mozambiki Quelimane kikötőjénél elérte a Csendes-óceánt, azaz átszelte Afrikát. Angliában hősként fogadták, 1857-ben közzétett úti beszámolója 70 ezer példányban kelt el.
A brit hatóságok ezután egy újabb expedíció vezetésével bízták meg, de gőzhajója nem tudott felhatolni a Zambézi folyón, eljutott azonban a Nyasza-tóig és felfedezte a Chilwa-tavat. Az expedíción vele tartott felesége is, aki azonban az útközben meghalt. A felfedező 1864-ben visszatért Angliába, az útról írt könyvében szó esik a kininről mint a malária esetleges gyógyszeréről, sőt összefüggést keresett a malária terjedése és a fertőzött szúnyogok között.
1866-ban újabb expedíciót vezetett Afrikába és a missziós munka mellett a közép-afrikai vízválasztó és a Nílus-források felkutatását is célul tűzte ki. Afrikai és indiai kísérőkkel indult Tanzániából, de összeütközésbe kerültek a ngoni törzzsel, emiatt a tervezettnél délebbre fordultak. Kísérői közül többen megszöktek, ők azt terjesztették, hogy Livingstone-t megölték a ngonik. Mivel hírek valóban nem érkeztek róla, egyre furább legendák kaptak lábra, a brit Royal Society expedíciót indított felkutatására, de nem jártak sikerrel.
Livingstone eközben zavartalanul folytatta útját, felfedezte a Mweru-, majd a Bangweulu-tavat, 1869 elején kiért a Tanganyika-tóhoz, két év múlva a Kongó egyik ágához, és már nyugatabbra járt, mint addig bármely fehér ember. Fél év múlva visszafelé indult, 1871. november 10-én összetalálkozott Henry Stanleyvel, aki egy amerikai lap megbízásából őt kereste Afrika mélyén. Stanley angolos kimértséggel üdvözölte a rajta kívül több ezer kilométeres körzetben egyetlen fehér embert: "Ugyebár Doktor Livingstone-hoz van szerencsém?" A két férfi között barátság alakult ki, együtt térképezték fel a Tanganyika-tó északi partját. Stanley, akire Livingstone jegyzeteit és naplóit is rábízta, egy idő után visszafordult, és a partvidéken gondoskodott arról, hogy Livingstone készleteit feltöltsék. Az utánpótlást szállító expedíció azonban már csak az idős kutató holttestét szállító bennszülöttekkel találkozott: Livingstone a mai Zambia területén fekvő Chitambóban halt 1873. május 1-jén.
Bebalzsamozott testét a londoni Westminster-apátságban temették el, emlékét Afrikában a róla elnevezett hegység és a Kongó folyó egyik vízesése őrzi.